豬圓環病毒 2 型原位雜交檢測技術的構建及應用

摘要

豬圓環病毒 2 型（PCV2）是危害養豬業的重要病原，精準檢測其在組織中的分布是疫病防控關鍵。本研究基于威尼德 HB-500 原位雜交儀，構建 PCV2 特異性熒光原位雜交（FISH）檢測技術。通過設計靶向 ORF2 基因探針并優化雜交條件，實現 PCV2 在豬腎細胞及組織樣本中的單細胞水平定位，為 PCV2 致病機制研究與臨床快速診斷提供高效技術平臺。

一、引言

豬圓環病毒 2 型（Porcine circovirus type 2, PCV2）是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）等疾病的主要病原體，嚴重威脅全球養豬業健康發展。該病毒具有感染隱蔽性強、免疫逃逸能力突出等特點，傳統檢測方法如 PCR 雖能定量病毒核酸，但無法直觀呈現病毒在組織細胞中的時空分布；免疫組化技術依賴抗體特異性，易受交叉反應干擾，且難以實現單細胞層面的精準定位。

熒光原位雜交技術（Fluorescence in situ hybridization, FISH）通過熒光標記的 DNA 探針與靶病毒核酸序列特異性結合，可在組織切片或細胞樣本中直接觀察病毒分布，兼具高特異性與可視化優勢。該技術不僅能準確識別 PCV2 感染的靶細胞類型，還可分析病毒在宿主組織中的定植模式，為解析 PCV2 致病機制、評估疫苗免疫效果提供關鍵細胞學證據。

威尼德 HB-500 原位雜交儀作為分子病理檢測的核心設備，為 PCV2 的 FISH 檢測提供了精準可控的實驗平臺。其搭載的模糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術，實現 12 張玻片全域溫差≤±1℃，確保雜交過程中溫度均一性，避免因溫度波動導致的探針非特異性結合；全密封濕度控制系統維持≥90% RH 恒濕環境，有效防止雜交液揮發，顯著提升探針與病毒核酸的結合效率。儀器支持全自動變性 - 雜交一體化流程，配合 7 英寸智能觸控屏與 110 組用戶程序預設功能，可大幅簡化操作步驟、縮短實驗周期，為 PCV2 的高通量檢測與大規模流行病學調查提供技術保障。本研究旨在建立基于威尼德 HB-500 原位雜交儀的 PCV2 原位雜交檢測方法，驗證其在獸醫病理學與臨床診斷中的應用價值。

二、材料與方法

（一）實驗材料

1. 1. 生物樣本：

• 病毒株：PCV2 分離株（基因型為 PCV2d），由某獸醫研究所提供，接種于 PK-15 豬腎細胞進行增殖培養，收集感染 72 h 的細胞樣本（用于細胞水平檢測）。

• 組織樣本：人工感染 PCV2 的 SPF 仔豬腎臟、淋巴結組織（經病理切片驗證為典型 PCV2 感染病變），以及健康仔豬對應組織作為陰性對照，樣本經 4% 多聚甲醛固定、石蠟包埋備用。

2. 2. 探針設計與制備：

• 靶序列選擇 PCV2 基因組中高度保守的 ORF2 基因區域（核苷酸位置 500-700 bp），設計特異性 DNA 探針（長度 50 bp），5' 端標記 FITC 熒光素（綠色熒光，激發波長 488 nm），由某生物科技公司合成并純化。

• 內參探針：豬 β-actin 基因探針（標記為 Cy3 熒光素，紅色熒光，激發波長 570 nm），用于細胞定位與背景信號校準。

（二）主要試劑

實驗所用試劑包括某試劑（用于細胞固定、探針稀釋及雜交緩沖液配制）、4% 多聚甲醛（pH 7.2）、1×PBS 緩沖液、20×SSC（含 3 M NaCl，0.3 M 檸檬酸鈉，pH 7.0）、甲酰胺、硫酸葡聚糖、鮭魚精 DNA、DAPI 復染劑（1 μg/mL）、抗熒光淬滅封片劑等，均為分析純級別。

（三）主要儀器

威尼德 HB-500 原位雜交儀（具備精準控溫、全自動變性 - 雜交功能，支持 12 張玻片并行處理）、熒光顯微鏡（配備 UV、綠光、紅光激發模塊）、石蠟切片機、恒溫振蕩水浴鍋、高速冷凍離心機、顯微操作儀、移液器等。

（四）實驗方法

1. 樣本預處理

• 1. 細胞樣本制備：收集 PCV2 感染的 PK-15 細胞，用 4% 多聚甲醛固定 30 min，1×PBS 洗滌 3 次，制備細胞爬片；健康 PK-15 細胞作為陰性對照。

• 2. 組織樣本處理：石蠟包埋組織塊切成 5 μm 薄片，依次經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，置于 1×PBS 中待用；組織切片經胃蛋白酶溶液（10 μg/mL，37℃，10 min）消化以增強探針通透性，再次用梯度乙醇脫水，室溫晾干。

• 
  

2. 玻片預處理與變性

將細胞爬片或組織切片玻片放入威尼德 HB-500 原位雜交儀，70℃烘烤 2 h 增強樣本粘附力。隨后進行預處理：2×SSC（37℃，15 min）洗滌去除雜質，蛋白酶 K 溶液（20 μg/mL，37℃，8 min）消化蛋白質，經 70%、85%、100% 乙醇梯度脫水后晾干。

3. 探針混合與雜交程序

• 1. 雜交緩沖液配制：將 PCV2 ORF2 探針與 β-actin 探針分別以 1:100 比例溶于雜交緩沖液（含 50% 甲酰胺，10% 硫酸葡聚糖，2×SSC，100 μg/mL 鮭魚精 DNA），充分混勻后加入儀器探針槽。

• 2. 全自動變性 - 雜交流程：啟動威尼德 HB-500 原位雜交儀的 "病毒檢測專用程序"，首先對探針混合液在 95℃變性 10 min，立即冰浴 5 min；將變性探針均勻滴加于樣本玻片，覆蓋蓋玻片并密封。儀器自動升溫至 42℃預雜交 1 h，隨后降至 37℃進行過夜雜交（16-18 h）。過程中儀器實時監控溫度（全域溫差≤±1℃）與濕度（≥90% RH），確保探針與病毒核酸高效結合。

4. 洗片與信號檢測

雜交結束后，依次用 2×SSC（37℃，5 min×2 次）、1×SSC（37℃，10 min）、0.5×SSC（37℃，10 min）洗片以去除未結合探針，蒸餾水漂洗后晾干。滴加 DAPI 復染劑室溫孵育 10 min，抗熒光淬滅封片劑封片。

在熒光顯微鏡下觀察，PCV2 ORF2 探針信號呈綠色熒光，β-actin 探針信號呈紅色熒光（標記宿主細胞骨架），DAPI 復染細胞核呈藍色熒光。每個樣本隨機選取 50 個視野，統計熒光信號的細胞定位、強度及感染細胞比例。

三、結果與分析

（一）探針特異性驗證

在健康 PK-15 細胞與健康仔豬組織切片中，僅檢測到紅色熒光信號（β-actin 標記的宿主細胞），無綠色熒光信號；而在 PCV2 感染的 PK-15 細胞中，細胞質內可見明顯綠色熒光顆粒，呈散在或聚集分布；感染仔豬腎臟腎小管上皮細胞、淋巴結巨噬細胞的細胞質及細胞核周邊均觀察到強綠色熒光信號，與 PCV2 在宿主細胞中的復制位點一致。結果表明，ORF2 探針能特異性識別 PCV2 核酸，無交叉反應。

（二）PCV2 檢測靈敏度與定位分析

1. 1. 細胞水平檢測：在感染復數（MOI）為 0.1 的 PK-15 細胞中，可檢測到單個細胞內的綠色熒光信號，靈敏度達 103 拷貝 / 細胞；隨著感染時間延長（24-72 h），熒光信號強度逐漸增強，且在多核巨細胞中呈現區域性聚集分布，提示 PCV2 在細胞內的復制與組裝具有時空特異性。

2. 2. 組織原位定位：感染仔豬腎臟組織中，PCV2 信號主要定位于腎小管上皮細胞與腎間質巨噬細胞，腎小球區域未見明顯信號；淋巴結組織中，熒光信號集中于皮質區的淋巴細胞與竇組織細胞，髓質區信號較弱。該分布模式與 PCV2 所致間質性腎炎、淋巴結炎的病理損傷部位高度吻合，為解析病毒組織嗜性與致病機制提供了直觀證據。

（三）威尼德 HB-500 原位雜交儀性能評估

• 1. 控溫穩定性：連續 72 h 監測顯示，12 張玻片溫度波動均≤±1℃，不同玻片間 PCV2 信號強度變異系數＜8%，顯著優于傳統水浴鍋雜交（變異系數＞30%），避免了因局部溫度不均導致的假陰性結果。

• 2. 流程效率優化：全自動程序將傳統手動操作所需的 28-32 h 縮短至 20-22 h，且 "開蓋即操作" 的玻片卡槽設計減少了人工干預步驟，降低了污染風險。儀器支持多批次樣本并行處理，單次可同時檢測 12 份樣本，大幅提升批量檢測效率。

• 3. 數據可追溯性：儀器實時記錄溫度曲線、雜交時間等關鍵參數并支持 Excel 格式導出，為實驗重復性驗證與質量控制提供了量化依據。在 3 次獨立重復實驗中，相同樣本的熒光信號定位與強度一致性達 95% 以上，符合國際標準對分子病理檢測的可溯性要求。

四、結論

本研究成功構建了基于威尼德 HB-500 原位雜交儀的豬圓環病毒 2 型原位雜交檢測技術，實現了 PCV2 在細胞與組織樣本中的精準定位與可視化分析。該技術突破了傳統檢測方法的局限性，既能特異性識別病毒核酸，又能直觀呈現病毒在宿主中的感染路徑與細胞嗜性，為 PCV2 的致病機制研究、疫苗效果評價及臨床病理診斷提供了高效工具。

威尼德 HB-500 原位雜交儀憑借其精準的溫度控制、高效的全自動流程及智能的數據管理功能，顯著提升了 PCV2 原位雜交實驗的穩定性與操作效率。無論是獸醫實驗室的病原定位研究，還是規模化豬場的臨床樣本篩查，該儀器均能為科研人員與獸醫工作者提供高精度、可重復的檢測方案。

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參考文獻

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